中山七院干细胞外囊泡治疗输卵管炎症性不孕症

原标题：中山七院干细胞外囊泡治疗输卵管炎症性不孕症

作者：茵冠生物

导读：日前，由中山大学附属第七医院妇科李田团队从中分离提取外泌体并用于输卵管炎症性不孕症动物的体外实验，验证了外泌体可用于改善生殖能力，为未来外泌体治疗输卵管炎症性不孕症的临床应用奠定了坚实基础。题为《Human umbilical cord mesenchymal stem cells derived extracellular vesicles alleviate salpingitis by promoting M1–to–M2 transformation》的创新性研究成果发表于国际学术期刊《Frontiers in Physiology》上。

拥有一个健康快乐的宝宝对数百万家庭的幸福生活而言至关重要，然而越来越多的女性患者在沙眼衣原体（CT）感染后因慢性输卵管炎而出现不孕症。输卵管瘢痕的形成不仅是CT破坏了输卵管上皮细胞，还与炎症粘连有关。

炎症粘连是人类数万年进化过程中形成的一种正常生理过程。当体内出现炎症或者损伤时，组织器官在损伤修复过程中为了不让这些炎症扩散，形成了这种异常纤维化的病变从而将这些组织包裹起来。输卵管内层粘膜发生炎症粘连可以限制炎症，有利于组织损伤的修复，然而长期反复的炎症反应将导致输卵管管腔纤维化甚至瘢痕化，进而导致不孕症的发生。

间充质干细胞（MSCs）是源自中胚层的成体干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜力。以往的研究表明MSCs移植可以显著减少CT感染引起的输卵管炎的炎症。体外研究证实，MSCs可以通过旁分泌途径促进巨噬细胞从M1（促炎）转化为M2（抗炎）表型，然而，MSCs的临床应用仍存在争议。

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是细胞主动释放出来的纳米级膜囊泡，根据直径的大小，可细分为三大类：外泌体（30~150nm）、凋亡小体（10-5000nm）和微囊泡（100-1000nm），内含有核酸、蛋白质等活性物质。被分泌出来的EVs通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用，因此EVs也常被称为细胞信使。

与MSCs治疗相比，MSCs来源的细胞外囊泡（MSC-EV）发挥的功能与其源细胞的功能相似，包括修复与再生组织、免疫调节及重塑免疫微环境，而且MSC-EV的成分相对简单，其结构特征使它们能够高效率地到达靶组织，避免MSCs应用所带来的伦理问题及避免MSCs过多增殖的风险。

为此，中山七院妇科团队开展了人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡（hucMSC-EV）治疗CT输卵管炎的课题研究，探讨了hucMSC-EV在体内外巨噬细胞极化的调控机制，并探究该过程中对巨噬细胞的细胞因子分泌水平的影响，以期为CT感染所致输卵管炎的治疗提供新的思路。

▎提取干细胞外囊泡：

该研究实验所用的人脐带间充质干细胞来源于足月剖宫产产褥期新鲜脐带，产妇无妊娠糖尿病、感染、发烧、自身免疫性疾病或其他疾病。使用超速离心从培养至第3-5代干细胞的培养上清液中收集hucMSC-EV。

▎建立CT感染致小鼠输卵管炎性不孕症模型：

24只雌性4周龄C3H小鼠在分别于第3、7天皮下注射2.5mg甲羟孕酮，1周后经阴道注射1×10^7包涵体形成单位沙眼衣原体（MoPn 株）。为了防止衣原体流出阴道，注射后将小鼠倒挂1分钟。

▎治疗小鼠慢性输卵管炎模型：

2周后，将雌鼠随机分为三组hucMSC-EV（干细胞外囊泡组），DPBS（磷酸盐缓冲液对照组）和DMEM（含氨基酸和葡萄糖的培养液对照组），每组8只小鼠。hucMSC-EV组小鼠经阴道注射25μL的hucMSC-EV（100μg/mL），每3天注射3次。

▎治疗结果：

①　减轻炎症反应

2周后，随机选择每组三只小鼠进行解剖。经hucMSC-EV治疗后，小鼠输卵管和子宫局部充血以及炎性输卵管积水较对照组明显减少（如图A-F）。

he染色显示，hucMSC-EV组输卵管绒毛结构完整，DPBS组和DMEM组绒毛结构几乎消失，有明显组织积水导致的扩张（如图G-L）。上述结果表明hucMSC-EV可显著改善致病小鼠生殖道充血和炎症反应。

② 提高妊娠能力

为了测试雌鼠的妊娠能力，将每组剩余的5只雌鼠与2只雄性小鼠同笼饲养2周。当观察雌鼠有阴道栓时，表明该小鼠发生过交配行为，继续喂养7天以确定其子宫中是否存在胚胎。

结果hucMSC-EV组的5只小鼠均已怀孕，DPBS组无小鼠怀孕，DMEM组仅1只怀孕。（如图M-N）该结果进一步验证了hucMSC-EV可显著改善致病小鼠生殖道充血和炎症反应，从而提高妊娠率。

▎相关分子机制和信号通路

研究团队首先检测了与炎症信号通路相关的蛋白p65和TLR4，结果发现hucMSC-EV组p65和TLR4的表达水平显著低于DPBS组和DMEM组，这意味着p65和TLR4可能在hucMSC-EV介导的输卵管炎症缓解中发挥重要作用（如图O-P）。

随后，研究团队使用免疫荧光标记CD206（红色信号）来显示M2（抗炎）型巨噬细胞在输卵管组织中的分布，结果显示hucMSC-EV组的M2型巨噬细胞数量明显高于对照组，提示hucMSC-EV可能通过诱导巨噬细胞从M1型向M2型极化来抑制输卵管炎症反应（如上图A-I）。

之后，研究团队通过实验再次验证hucMSC-EV可以通过P65/TRAF6介导的NF-κB信号通路逆转LPS诱导的巨噬细胞转化，促进巨噬细胞从M1型转化为M2型，进而提高抗炎细胞因子IL-10的转录和分泌水平（如上图A-H）。

▲分子机制

总体而言，该研究开发了一种以人脐带间充质干细胞衍生物细胞外囊泡为基础的疗法，并在CT感染引起输卵管炎性不孕症小鼠模型验证了有效性。该疗法的分子机制在于hucMSC-EV可以通过NF-κB信号通路，诱导巨噬细胞从M1型到M2型极化，从而改善输卵管局部炎症微环境，治疗CT感染引起的慢性输卵管炎，最终改善生殖结局。

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